DNA

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12602 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wurzelläsionsnematoden (RLN) der Gattung Pratylenchus verursachen weltweit erhebliche Schäden im Getreideanbau. Aufgrund des Klimawandels und ohne effiziente und umweltfreundliche Behandlungen werden die Schäden durch RLNs voraussichtlich zunehmen. Mikroskopische Untersuchungen von RLNs im Feld und in Gewächshäusern sind zeitaufwändig und mühsam. Daher haben Getreidezüchter diesen Schädling weitgehend ignoriert. Wir präsentieren eine Methode zur Messung von RLN in infizierten Getreidewurzeln mithilfe eines standardisierten PCR-Ansatzes. Öffentlich verfügbare Pratylenchus Neglectus-Primerkombinationen wurden bewertet. Es wurde eine optimale Primerkombination für den RT-qPCR-Assay identifiziert, um P. Neglectus in infizierten Getreidewurzeln nachzuweisen und zu quantifizieren. Mithilfe des RT-qPCR-Nachweistests konnte P. Neglectus deutlich von anderen pflanzenparasitären Nematoden unterschieden werden. Wir konnten P. Neglectus-DNA in Gersten- und Weizenwurzeln mit nur 0,863 bzw. 0,916 ng/µl Gesamt-DNA identifizieren. Ein einzelnes P. Neglectus-Individuum wurde in Wassersuspension sowie in Gersten- und Weizenwurzeln nachgewiesen. Der RT-qPCR-Nachweistest bietet eine robuste und genaue Alternative zur mikroskopischen Nematodenidentifizierung und -quantifizierung. Es könnte für die Resistenzzüchtung von Interesse sein, bei der große Populationen untersucht werden müssen, um P. Neglectus auf den Feldern der Landwirte nachzuweisen und zu quantifizieren.

Es sind etwa 4100 Arten pflanzenparasitärer Nematoden (PPN) bekannt1. Viele davon sind verheerende Schädlinge in der Landwirtschaft und im Gartenbau weltweit2,3. Beispielsweise wird der durch Pflanzen-PPNs verursachte weltweite Ertragsverlust auf etwa 15 % geschätzt, wobei die Verluste in einigen Regionen über 50 % betragen4,5,6.

Wurzelläsionsnematoden (RLN) der Gattung Pratylenchus sind nach Wurzelknoten- und Zystennematoden die drittschädigendsten PPNs für Nutzpflanzen weltweit7,8. Der Schaden durch RLN wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst, darunter beteiligte Nematodenarten, Klima, Wirtsgebiet, Nematodenvirulenz und Anbausysteme. Studien haben ergeben, dass durch RLNs verursachte Ertragsverluste bei verschiedenen Kulturpflanzen je nach Kulturpflanze und Schwere des Befalls zwischen 5 und 50 % liegen2,7.

Pratylenchus Neglectus und P. thornei sind die beiden wichtigsten RLNs in Getreide. Die P. Neglectus-Population im Boden korreliert negativ mit dem Weizenkornertrag9. In Australien kann der Weizenertrag um bis zu 30 % sinken10. P. Neglectus wurde in mehr als 90 % der Trockenweizenfelder im pazifischen Nordwesten der Vereinigten Staaten nachgewiesen, wo der Schaden auf 51 Millionen US-Dollar pro Jahr geschätzt wird11,12,13. In Europa verwenden Landwirte enge Fruchtfolgen und frühe Aussaattermine, was zu zunehmenden Schäden durch RLNs führt14,15. Bei einer Untersuchung von PPNs im ökologischen Landbau in Deutschland wurden in über 90 % der gesammelten Bodenproben die Gattungen Pratylenchus und Tylenchorhynchus entdeckt16. RLNs wurden aufgrund ihrer Artenvielfalt, ihres Migrationsverhaltens, ihrer morphologischen Ähnlichkeiten, ähnlicher Schädigungssymptome durch andere bodenbürtige Krankheitserreger oder Umweltbelastungen sowie des Mangels an ausgebildeten Nematologen oft übersehen17. Die Identifizierung von Nematoden anhand morphologischer Merkmale ist zeitaufwändig und erfordert großes Fachwissen für die Klassifizierung von Nematoden. Der Quantifizierungsprozess nimmt Zeit in Anspruch und das Zählen und Identifizieren dieser Arten aus vielen Proben ist eine Herausforderung, insbesondere wenn andere Nematoden vorhanden sind. Beispielsweise unterscheidet man P. neglectus von P. thornei und anderen eng verwandten Pratylenchus-Arten. basiert auf geringfügigen morphologischen Merkmalen in Bezug auf die Anzahl der Lippenringe, die Schwanzform und die Position der Vulva18. Darüber hinaus kann die Artenidentifizierung durch Umweltbedingungen und phänotypische Variationen erschwert werden13,19. Aufgrund dieser Herausforderungen besteht die Notwendigkeit, einfache und schnelle Diagnosestrategien zur Identifizierung von Nematoden zu entwickeln. Die Kombination morphologischer und molekularer Daten ist ideal für die Verbesserung der Auflösung und Zuverlässigkeit diagnostischer Studien20.

Als schnelle Alternative zu mikroskopischen Analysen hat sich die DNA-basierte Nematodendiagnostik etabliert. Kommerzielle Labore bieten umfassende DNA-basierte Tests zur Quantifizierung verschiedener durch den Boden übertragener Krankheiten an21,22. Die Details der verwendeten Protokolle gelten jedoch als proprietär und sind nicht offen verfügbar. Es wurden jedoch PCR-basierte Ansätze zur Differenzierung von PPN-Arten entwickelt. Beispielsweise könnte eine Methode, die das Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit-I-Gen (mtCOI) und die Internal Transscribed Spacer-Sequenzen (ITS) verwendet, Kartoffelzystennematoden identifizieren und ihre Verbreitung in Indonesien verfolgen23. Ebenso haben mtCOI-Primerkombinationen vier Aphelenchoides-Arten unterschieden24. In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass mtCOI- und 18S-rRNA-spezifische Primerkombinationen zur Identifizierung mariner Nematoden und zur Bereitstellung von Belegexemplaren verwendet wurden. Dieses konservierte Exemplar dient als überprüfbarer und dauerhafter Nachweis von Nematoden25. Boroş et al. verwendeten Primerkombinationen, die an die Cytochromoxidase II (mtCO2) und die 16S-rRNA-Gene bindeten, um vier verschiedene Meloidogyne-Arten zu identifizieren26. Die meisten PCR-basierten molekulardiagnostischen Verfahren identifizieren Pratylenchus spp. durch Nutzung artspezifischer ribosomaler DNA (rDNA)-Polymorphismen. Molekulardiagnostische Tests für ein breites Spektrum von Pratylenchus spp. wurden etabliert, hauptsächlich basierend auf tandemartig angeordneten rDNA-Genen, die in vielen Kopien im Genom vorhanden sind27,28. Dabei wurden RT-qPCR-Ansätze zur Identifizierung von P. vulnus aus Reinkultur und Boden29,30 und zufällig amplifizierte polymorphe DNA-Fragmente (RAPD) zur Identifizierung von P. thornei aus Nematodenisolaten auf Karottenscheiben31 entwickelt. Ein auf SYBR® Green-I basierender RT-qPCR-Test zum Nachweis und zur Quantifizierung des Wurzelläsionsnematoden P. zeae, des Wurzelknotennematoden Meloidogyne javanica und des Dolchnematoden Xiphinema elongatum aus dem Boden32 wurde etabliert. Darüber hinaus wurden RT-qPCR-basierte Protokolle zum Nachweis von P. penetrans33 und P. thornei34 aus Boden-DNA-Proben entwickelt.

Al-Banna et al.27 berichteten über die Differenzierung von sechs Pratylenchus-Arten, darunter P. neglectus und P. thornei, aus Bodenproben mittels PCR. Sie entwarfen eine artspezifische Primerkombination innerhalb der D3-Expansionsdomäne der 26S-rDNA in einem herkömmlichen PCR-basierten Assay zum Nachweis von P. Neglectus. Ebenso entwarfen Yan et al.28 Primerkombinationen aus derselben Genomregion, um P. neglectus und P. thornei aus Bodenproben zu identifizieren, wenn auch mit geringer Empfindlichkeit. Daher entwickelten Yan et al.35 eine neue Primerkombination zum Nachweis und zur Quantifizierung von P. Neglectus im Boden innerhalb der ITS1- und 5.8S-Regionen unter Verwendung einer SYBR® Green-I-basierten RT-qPCR-Methode. Unter Verwendung öffentlich verfügbarer Sequenzinformationen entwarfen Peetz und Zasada36 artspezifische Primerkombinationen basierend auf dem β-1,4-Endoglucanase-Gen für verschiedene Pratylenchus-Arten (P. crenatus, P. Neglectus, P. penetrans und P. thornei), die sie verwendeten zur Bodenüberwachung im pazifischen Nordwesten Nordamerikas eingesetzt. Drei weitere Studien verwendeten eine TaqMan-basierte RT-qPCR mit artspezifischen Primerkombinationen zum Nachweis von P. Neglectus. Jayatilake et al.37 entwickelten eine artspezifische Primerkombination aus ribosomaler rDNA der großen 28S-Untereinheit, um P. Neglectus in infizierten Weizenwurzeln nachzuweisen und zu quantifizieren. Oliveira et al.38 berichteten über einen auf einem RT-qPCR-Assay basierenden Assay zum Nachweis von P. crenatus, P. penetrans und P. Neglectus in Bodenproben. Sie berechneten die Anzahl der ITS-1-Kopien pro P. Neglectus-Nematoden. Schließlich etablierten Lin et al.39 eine Duplex-Echtzeit-qPCR mit einer artspezifischen Primerkombination innerhalb der D2D3-Expansionsdomäne der 28S-rDNA zum Nachweis und zur Quantifizierung von P. neglectus und P. thornei in Bodenproben, die empfindlich genug für den Nachweis war ein einzelner Fadenwurm in einer Population von Nichtzielnematoden.

Alle veröffentlichten Methoden wurden für den Nachweis und die Quantifizierung von P. Neglectus in Wassersuspensionen und Bodenproben entwickelt. Darüber hinaus fehlen DNA-Isolierung und RT-qPCR-basierte Protokolle zum Nachweis und zur Quantifizierung von P. Neglectus in Getreidewurzeln. Daher führten wir eine Vergleichsstudie mit veröffentlichten Primerkombinationen durch, um ein Protokoll für den schnellen und routinemäßigen Nachweis und die Quantifizierung von P. Neglectus in infizierten Getreidewurzeln zu erstellen. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll für die DNA-Extraktion aus infizierten Wurzeln erstellt und eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die effektivste Primerkombination für den Nachweis von P. Neglectus auszuwählen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht eine präzise, ​​empfindliche und effiziente Diagnose und Identifizierung von P. Neglectus im Wurzelgewebe von Pflanzen.

Wir haben die Literatur und die Genbank-Datenbank nach P. Neglectus-spezifischen Primerkombinationen durchsucht (Ergänzungstabelle 2). Die Sequenz, die den Neg1-Primer35 flankiert, war mit allen verfügbaren P. Neglectus-Sequenzen identisch, einschließlich der Zugangsnummer KY468880.1, die als P. crenatus eingereicht wurde. Die morphologische Beschreibung dieses Isolats wurde nicht veröffentlicht, seine Sequenz unterscheidet sich jedoch von allen anderen P. crenatus-Genbank-Sequenzen, ist jedoch P. neglectus sehr ähnlich. Die Sequenz, die den Neg2-Primer36 flankiert, zeigte nur wenige P. Neglectus-BLAST-Treffer und wurde daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die Sequenz aus der 28S-rRNA-D3-Expansion, die den Neg3-Primer28 flankiert, wurde ebenfalls verworfen, da sie eine hohe Ähnlichkeit mit Sequenzen anderer Pratylenchus-Arten wie P. minyus, P. kumamotoensis und P. vulnus aufweist. Die Neg4-Vorwärtsprimersequenz27 (Neg4-fw; Ergänzungstabelle 2) zeigte keine BLAST-Treffer, da ihr an Position 13 ein Primernukleotid fehlte. Das Einfügen eines Adenins an dieser Position führte jedoch zu einer Primersequenz mit 100 % Identität zu allen P . Neglectus-Sequenzen aus der Datenbank.

Alle Primerkombinationen wurden separat mit vier Populationen verschiedener Arten von P. Neglectus-DNA getestet. Als Kontrollen wurde die Gesamt-DNA aus Gerste und Weizen verwendet, die entweder mit P. Neglectus allein oder mit einer Mischung aller vier Arten inokuliert waren (Ergänzungstabelle 1; Ergänzungstabelle 3). Als Ergebnis ergab die Neg1-Primerkombination das erwartete PCR-Produkt von 234 bp (Abb. 1A), während mit Nicht-Ziel-Nematoden-DNA kein Amplifikationsprodukt gefunden wurde. Es zeigte die zuverlässigsten PCR-Ergebnisse aufgrund der starken und deutlichen Banden in Gegenwart von P. Neglectus-DNA (Abb. 1A). Amplifikationskurven (Abb. 1B) und ein einzelner Schmelzpeak bei 81,5 °C (Abb. 1C) für Proben, die reine P. Neglectus-DNA, DNA aus mit P. Neglectus inokulierter Gerste und Weizen sowie DNA aus mit einer Mischung verschiedener beimpfter Gerste enthalten RLN-Arten zeigen das Potenzial dieser Primerkombination zur Amplifikation von P. Neglectus-DNA aus verschiedenen Quellen.

Ergebnisse der PCR- und RT-qPCR-Experimente mit RLN-DNA unter Verwendung der Neg1-Primerkombination. Die Primersequenzen, Annealing-Temperaturen und die erwarteten Fragmentgrößen sowie das Material und die Methode sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. (A) Agarosegel (3 %, 80 V für 60 Min.) mit PCR-Fragmenten, amplifiziert mit DNA aus verschiedenen RLN-Arten und mit P. Neglectus infizierten Getreidewurzeln, (B) RT-qPCR-Amplifikationskurven mit DNA aus Pratylenchus Neglectus, Getreidewurzeln infiziert mit P. Neglectus, anderen Pratylenchus-Arten und nicht infizierten Wurzeln. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von drei technischen Replikaten dar. (C) Schmelzkurvenprofile von P. Neglectus-spezifischen Amplicons. Der Höhepunkt liegt bei 81,5 °C. Keiner der Nicht-P. Neglectus-Verstärkungskurven berühren die Schwellenlinie.

Mit der Neg2-Primerkombination wurde ein P. Neglectus-spezifisches PCR-Produkt von 293 bp mit sichtbaren Primerdimeren in Abwesenheit einer DNA-Matrize erzeugt (ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus zeigten die Amplifikationskurven eine geringere Nachweisempfindlichkeit mit zwei bis drei Zyklen mehr, bevor der Schwellenwert erreicht wurde (ergänzende Abbildung 2A; ergänzende Tabelle 3). Die Schmelzkurvenanalysen zeigten einen einzelnen Peak bei 88,5 °C (ergänzende Abbildung 2B). Die Neg3-Primerkombination ergab ein PCR-Produkt von 144 bp, in den Proben ohne Matrizen-DNA waren jedoch Primerdimere sichtbar (ergänzende Abbildung 1). Die RT-qPCR-Analysen zeigten Amplifikationskurven und einen Mangel an Empfindlichkeit in inokulierten Gersten- und Weizenproben, mit ein bis zwei Zyklen mehr bis zum Erreichen des Schwellenwerts (Ergänzende Abbildung 2C; Ergänzende Tabelle 3) mit einem einzigen Schmelzpeak bei 90,5 °C ( Ergänzende Abbildung 2D). Die PCR mit der Neg4-Primerkombination führte zu zwei Amplikons, einer Bande mit der erwarteten Größe von 290 bp und einer zweiten schwachen Bande von 200 bp (ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus sind die Amplifikationskurven ungefähr parallel, die Kurven liegen nahe beieinander (ergänzende Abbildung 2E; ergänzende Tabelle 3) und die Schmelzkurvenanalyse ergab zwei Peaks bei 85 ° C und 90, 5 ° C, was auf die Amplifikation von a hinweist unspezifisches Fragment (ergänzende Abbildung 2F).

Alle PCR-Produkte wurden in beide Richtungen Sanger-sequenziert. Alle Sequenzen zeigten eine hohe Ähnlichkeit mit den erwarteten PCR-Produktsequenzen und einer Referenzdatenbank bekannter Sequenzen (Daten nicht gezeigt).

Zuerst führten wir serielle Verdünnungen der DNA von P. Neglectus durch (von unverdünnter DNA, 1:0 bis 1:1000), um die Empfindlichkeit der RT-qPCR-Assays anhand der DNA von 2000 P. Neglectus-Individuen unter Verwendung der Neg1-Primerkombination zu überprüfen (Tabelle 1). Die Ergebnisse zeigten eine Korrelation zwischen der DNA-Konzentration serieller Verdünnungen und den Cq-Werten. Die niedrigsten (16,55 ± 0,01) und höchsten (28,87 ± 0,20) Cq-Werte wurden mit 53,4 ng DNA/µl bzw. 0,053 ng DNA/µl erhalten (ergänzende Abbildung 5; Tabelle 1). Wir haben auch alle PPN-Arten mit der Neg1-Primerkombination gescreent und alle P. Neglectus-Isolate effektiv nachgewiesen, ohne Nicht-Ziel-Nematoden nachzuweisen (Ergänzungsabbildung 3, Ergänzungstabelle 1).

Anschließend wurden Gersten- und Weizenpflanzen mit 1000 P. Neglectus infiziert. Acht Wochen nach der Inokulation wurden die Pflanzen geerntet und, wie im Material und in der Methode beschrieben, eine modifizierte DNA-Isolierungsmethode verwendet, um die Gesamt-DNA aus infizierten Wurzeln zu isolieren. Die erhaltene Gesamt-DNA wurde für die DNA-Qualitätsprüfung und PCR/RT-qPCR-Experimente auf 836,4 bzw. 916,4 ng/µl für Gerste und Weizen verdünnt (Tabelle 1). PCR mit Neg1-Primerkombination führte zu sichtbaren Amplikons der erwarteten Größe (ergänzende Abbildung 4). Anschließend führten wir eine RT-qPCR mit derselben Primerkombination und einer Reihe von DNA-Verdünnungen (1:0–1:1000) durch. Die Cq-Werte lagen zwischen 20,93 ± 1,14 und 29,02 ± 0,17 für Gerste und 20,99 ± 1,04 bis 29,84 ± 0,54 für Weizen (Ergänzende Abbildung 5; Tabelle 1). Die Effizienz der RT-qPCR für diese Reihenverdünnungen betrug 87 % für Gerste und 84 % für Weizen. Der Effizienzwert gibt an, wie stark die RT-qPCR-Reaktion die Ziel-Nukleinsäuresequenz amplifizieren kann. Die linearen Regressionskurven von DNA-Serienverdünnungen von P. Neglectus und infizierten Gersten- und Weizenwurzeln zeigen, dass Nematoden-DNA sogar in stark verdünnter Wurzel-DNA nachgewiesen werden konnte (Abb. 2). Hohe R2-Werte in allen Kurven zeigen eine positive Korrelation zwischen der DNA-Konzentration aus den Reihenverdünnungen und den Cq-Werten. Diese Ergebnisse zeigen, dass der RT-qPCR-Assay empfindlich auf den Nachweis geringer Mengen an P. Neglectus-DNA reagiert, die aus Wassersuspension und infizierten Getreidewurzeln isoliert wurde (Abb. 2; Tabelle 1).

Werte des Quantifizierungszyklus (Cq), aufgetragen gegen Reihenverdünnungen von DNA. RT-qPCR wurde unter Verwendung der Neg1-Primerkombination durchgeführt. (A) Regressionskurve mit Reihenverdünnungen reiner P. Neglectus-DNA, die aus 2000 Individuen extrahiert wurde, (B) Regressionskurve mit Reihenverdünnungen der Gesamt-DNA, die aus infizierten Gerstenwurzeln isoliert wurde, (C) Regressionskurve mit Reihenverdünnungen der Gesamt-DNA, die aus infizierten Gerstenwurzeln isoliert wurde Weizenwurzeln. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von drei technischen Replikaten dar. Die Standardabweichung gibt die Variation zwischen drei technischen Replikaten an (siehe Tabelle 1).

Als nächstes wollten wir den Zusammenhang zwischen der Anzahl der Nematoden und der Häufigkeit der mittels RT-qPCR gemessenen Nematoden-DNA bestimmen. Zwischen einem und 2000 P. Neglectus-Nematoden wurden unter einem Stereomikroskop gesammelt und die DNA jeder Probe isoliert (Tabelle 2). Nach RT-qPCR lagen die Cq-Werte zwischen 28,76 ± 0,08 und 16,74 ± 0,04 für einen Nematoden bzw. 2000 Nematoden (Tabelle 2). Für jede Verdünnung wurden klare und deutliche Amplifikationskurven erhalten (Abb. 3A; ergänzende Abb. 6) mit einer Gesamteffizienz von 95 % für RT-qPCR. Die lineare Regressionskurve zeigte eine starke negative Korrelation zwischen den Cq-Werten und der Anzahl der Nematoden (R2 = 0,98) (Abb. 3B). Dies zeigt, dass die Neg1-Primerkombination und der RT-qPCR-Assay zur Quantifizierung von P. neglectus geeignet sind.

RT-qPCR-Experimente mit P. Neglectus-DNA isolieren PnGLS4 aus einer unterschiedlichen Anzahl von Nematoden. Es wurde die Primerkombination Neg1 verwendet. (A) RT-qPCR-Amplifikationskurven mit DNA, die aus Proben mit unterschiedlicher Anzahl von Nematoden isoliert wurde. (B) Regressionskurve mit Quantifizierungszyklus-Werten (Cq), die nach der Durchführung von RT-qPCR mit DNA erhalten wurden, die aus einer unterschiedlichen Anzahl von Nematoden isoliert wurde. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert der Cq-Werte aus drei unabhängigen Reaktionen dar.

Wir führten zwei Experimente („A“ und „B“) im Gewächshaus durch, um die Spezifität und Empfindlichkeit des RT-qPCR-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von P. Neglectus in infizierten Wurzeln zu überprüfen. Im Experiment „A“ wurden Gerste und Weizen mit vier verschiedenen Pratylenchus-Arten (P. neglectus, P. crenatus, P. penetrans und P. thornei) einzeln oder als Mischung aller Arten infiziert. Acht Wochen nach der Inokulation mit 1000 Nematoden wurden die physiologischen Merkmale gemessen (Ergänzende Abbildungen 7 und 10). Anschließend wurden die Wurzelproben in zwei Gruppen aufgeteilt, eine zur Nematodenzählung und die andere zur DNA-Isolierung und RT-qPCR. Die Anzahl der gezählten Nematoden lag zwischen 161 ± 72 und 1856 ± 198 für Gerste und 154 ± 82 bis 1804 ± 135 für Weizen (Abb. 4A; Tabelle 3). Die meisten Nematoden wurden bei Behandlungen nur nach einer Infektion mit P. Neglectus und nach einer Infektion mit einer Mischung von Arten gefunden (Abb. 4A; Tabelle 3), wobei eine P. Neglectus-spezifische Primerkombination auch eine DNA-Matrize von P. Neglectus detektierte (Abb . 4B; Tabelle 3). Interessanterweise waren die Infektionsraten zwischen Gerste und Weizen nach einer Infektion nur mit P. Neglectus nahezu ähnlich (Gerste 1,86 ± 0,20, Weizen 1,80 ± 0,14) (Tabelle 3). Im Gegensatz dazu sind Gerste und Weizen schlechte Wirte für P. crenatus und P. penetrans, was durch die niedrige Endzahl der Nematoden und Pf/Pi-Werte angezeigt wird (Abb. 4A; Tabelle 3).

Inokulationsexperimente mit verschiedenen RLN-Arten. Pflanzen wurden mit 1000 Nematoden verschiedener Pratylenchus-Arten einzeln oder als Mischung aller Arten inokuliert (siehe Tabelle 3). Die Wurzeln wurden acht Wochen nach der Inokulation geerntet und in zwei Gruppen aufgeteilt. Aus einer Gruppe wurde DNA isoliert und aus der anderen Gruppe wurden Nematoden gezählt. RT-qPCR wurde unter Verwendung der Neg1-Primerkombination durchgeführt. (A) Die Anzahl der Nematoden nach visueller Zählung; (B) Quantifizierungszyklus (Cq)-Werte. Einzel- und Mittelwerte werden als schwarze bzw. rote Punkte markiert. Das obere und untere Quartil werden durch den Median (horizontale Linie) getrennt. Blaue Dreiecke stellen Ausreißer dar. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts aus biologischen Replikaten dar. Es wurde ein ANOVA-Test (p < 0,05) durchgeführt und signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einen Tukey-Test (p < 0,05) berechnet. Unterschiedliche Buchstaben (a–d), Großbuchstaben zwischen Gerstenpflanzen und Kleinbuchstaben zwischen Weizenpflanzen über den Fehlerbalken stellen Gruppen basierend auf der Signifikanz dar (siehe Tabelle 3).

Anschließend verglichen wir die Ergebnisse der Nematodenzählung und der RT-qPCR-Daten unter Verwendung einer Neg1- und P. Neglectus-spezifischen Primerkombination. Nach der Infektion mit reinem P. Neglectus-Inokulum betrugen die Cq-Werte für Gerste und Weizen 19,95 ± 1,74 bzw. 19,42 ± 1,06. Nach Mischinfektionen mit verschiedenen Nematodenarten waren sie deutlich niedriger (Gerste 23,58 ± 0,92; Weizen 23,90 ± 1,58). Wie erwartet überschritten die Amplifikationskurven, die mit DNA von Wurzeln erhalten wurden, die nicht mit P. Neglectus infiziert waren, die Schwellenlinie nicht (Tabelle 3). Dies bestätigte die Speziesspezifität des RT-qPCR-Nachweistests (Abb. 4B; Tabelle 3). Es ist auch wichtig zu beachten, dass P. Neglectus nach Mischinfektionen im Gegensatz zu einer langwierigen und zeitaufwändigen Mikroskopie genau identifiziert werden kann.

Im nächsten Experiment („B“) haben wir die Empfindlichkeit des DNA-basierten Nachweistests bestimmt. Wir gingen davon aus, dass die Werte des Quantifizierungszyklus (Cq) mit der Anzahl der Nematoden korrelieren. Gersten- und Weizenpflanzen wurden mit unterschiedlicher Anzahl von P. Neglectus infiziert und acht Wochen nach der Inokulation wurden der Chlorophyllgehalt, die Trockenwurzel und das Sprossgewicht gemessen. Infolgedessen wirkte sich die zunehmende Anzahl von Nematoden negativ auf diese Parameter aus (Ergänzende Abbildungen 8 und 10). Nach der Ernte wurde die Hälfte der Wurzelproben zur Nematodenzählung und die andere Hälfte zur DNA-Isolierung und RT-qPCR verwendet. Die Nematoden in den Wurzeln wurden unter dem Mikroskop gezählt. Die Reproduktionsraten (Pf/Pi) nahmen mit zunehmender Anzahl von Nematoden im Inokulum ab (Tabelle 4). Nach der Inokulation mit 250 Nematoden lag das Verhältnis zwischen 2,42 ± 0,52 und 2,95 ± 0,47 für Weizen und Gerste, wohingegen nach der Inokulation mit 2000 Nematoden ein viel niedrigeres Verhältnis festgestellt wurde (für Gerste und Weizen jeweils 0,95 ± 0,05). Die höchste Endzahl an Nematoden ergab eine Infektion mit 1000 bzw. 2000 P. Neglectus-Nematoden. Nach der Infektion lag die endgültige Anzahl der Nematoden mit 1000 P. Neglectus zwischen 1793 ± 122 und 1785 ± 139 für Gerste bzw. Weizen (Abb. 5A; Tabelle 4). Die Cq-Werte lagen zwischen 21,20 ± 1,10 und 22,13 ± 1,70 (Abb. 5B; Tabelle 4). Die Anzahl der Nematoden lag nach Inokulation mit 2000 Nematoden im gleichen Bereich (Gerste 1905 ± 108, Weizen 1891 ± 110) (Abb. 5A); Allerdings waren die Cq-Werte deutlich niedriger (Gerste 17,82 ± 0,85, Weizen 17,76 ± 1,02) (Abb. 5B; Tabelle 4). Darüber hinaus war die Korrelation zwischen den Cq-Werten und dem anfänglichen Nematoden-Inokulum negativ, wobei R2 für Gerste bzw. Weizen zwischen 0,97 und 0,94 lag (ergänzende Abbildung 9), was durch die Tatsache erklärt werden konnte, dass DNA aus Eiern und toten Nematoden vorhanden war verstärkt. Gleichzeitig kann mit der visuellen Zählmethode nur die Anzahl lebensfähiger Nematoden ermittelt werden.

Inokulationsexperimente mit unterschiedlicher Anzahl von P. Neglectus-Isolaten PnGLS4, um die Korrelation zwischen den Ergebnissen der Nematodenzählung und der RT-qPCR zu bestimmen (siehe Tabelle 4). Pflanzen wurden mit unterschiedlich vielen Nematoden inokuliert. Acht Wochen nach der Inokulation wurden die Wurzelproben in zwei Gruppen aufgeteilt. Aus einer Gruppe wurde DNA isoliert und aus der anderen Gruppe wurden Nematoden gezählt. RT-qPCR wurde unter Verwendung der Neg1-Primerkombination durchgeführt. (A) Die Anzahl der unter einem Stereomikroskop gezählten Nematoden, (B) Quantifizierungszykluswerte (Cq) nach RT-qPCR. Für experimentelle Vorgehensweise und Statistiken siehe diese Abbildung.

Wir berechneten die lineare Regression zwischen den Cq-Werten und der Anzahl der gezählten Nematoden 8 Wochen nach der Inokulation, die eine negative Korrelation r(2) = −0,93, p < 0,001 und r(2) = −0,88, p < 0,001 für Gerste zeigte bzw. Weizen. Dadurch konnten wir anhand der Cq-Werte die Anzahl aller Nematoden in verschiedenen Entwicklungsstadien innerhalb einer Wurzel berechnen (Abb. 6).

Regressionen zwischen den Werten des Quantifizierungszyklus (Cq) und dem übertragenen Logarithmus der endgültigen Anzahl von Nematoden. Regressionen wurden mit Infektionsdaten von Weizen und Gerste berechnet. Zur Amplifikation wurde die Neg1-Primerkombination verwendet. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert aus fünfzehn biologischen und drei technischen Wiederholungen. Pflanzen wurden im Alter von 10 Tagen mit einer unterschiedlichen Anzahl von Nematoden pro Pflanze (250, 500, 1000 und 2000) inokuliert. Acht Wochen nach der Infektion wurden die Wurzeln geerntet (siehe Tabelle 4).

Wir haben einen RT-qPCR-Nachweistest zum Nachweis und zur Quantifizierung von P. Neglectus in Getreidewurzeln entwickelt. Wir nutzten öffentlich verfügbare Informationen zu Primerkombinationen und RLN-Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken, um die effektivste Neglectus-spezifische Primerkombination bis zur aktuellen Studie zu bewerten und zu identifizieren, um Verwirrung bei der Auswahl der artspezifischen Primerkombination zu vermeiden. Darüber hinaus stellten wir ein Protokoll zur Extraktion der gesamten DNA der infizierten Getreidewurzeln vor. Darüber hinaus haben wir uns auf einen SYBR® Green-basierten Ansatz konzentriert, da dieser erschwinglich, schnell und genau ist, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen. Es ist empfindlich genug, um die genomische DNA eines einzelnen Nematoden in einer Wassersuspension zu erkennen und um mindestens ~ 250 Nematoden in einer infizierten Wurzel zu erkennen.

Die gesamte DNA-Probe repräsentierte verschiedene Entwicklungsstadien des Fadenwurms, wie Jungtiere, Erwachsene, Eier und Wurzel-DNA. Sato et al.40 zeigten, dass die durch RT-qPCR bewertete Populationsdichte von P. penetrans im Boden je nach Mischung verschiedener Lebensstadien variieren kann. Sie beobachteten, dass die Cq-Werte von P. penetrans im adulten bis jugendlichen Stadium variieren können. Im Gegensatz dazu berichteten Yan et al.35 über keinen signifikanten Unterschied in den Cq-Werten zwischen einem einzelnen erwachsenen Weibchen, einem einzelnen Jungtier im zweiten Stadium und einem einzelnen Ei, was zeigt, dass verschiedene Lebensstadien von P. Neglectus relativ gleiche Mengen an DNA enthalten . Ihre Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Lebensstadien von P. Neglectus und die Anteile von Jungtieren, erwachsenen Weibchen und Eiern in einzelnen Proben keinen Einfluss auf den RT-qPCR-Nachweis und die Quantifizierung haben und daher wahrscheinlich nicht die Diskrepanz zwischen den durch RT gemessenen Nematodenwerten erklären -qPCR und binokulares Zählen. Dies folgt aus der Tatsache, dass P. Neglectus, wie die meisten Nematoden, während der frühen Embryonalentwicklung über eine feste Anzahl von Zellen und Kernen verfügt, die sich während des gesamten Lebenszyklus nicht ändert35.

Unter allen hier mit der SYBR® Green-Methode analysierten artspezifischen Primerkombinationen lieferte die Neg1-Primerkombination in dieser Studie die beste Leistung und spezifische Amplifikation aus den infizierten Wurzelproben, die P. Neglectus-DNA-Matrizen enthielten. Basierend auf Bioinformatik-, Labor- und Gewächshausuntersuchungen zeigte diese Primerkombination Spezifität, Empfindlichkeit und das Fehlen einer Sekundärstruktur. Diese Primerkombination bindet innerhalb der internen transkribierten Spacersequenzen der ITS1- und 5.8S-Regionen. Der linke Primer bindet an ITS1, während der rechte Primer an die 5.8S-Region bindet. Unsere Erkenntnisse, zusammen mit den vorhandenen Informationen über die Neg1-Primerregion und die Empfindlichkeit des Nachweises von Nematoden in Bodenproben, machen die Neg1-Primerkombination ideal für den Nachweis und die Identifizierung von P. Neglectus. Darüber hinaus zeigte die lineare Regressionskurve für unterschiedliche Anzahlen von Nematoden in Wassersuspension (1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 und 2000) eine starke negative Korrelation zwischen den Cq-Werten und der gezählten Anzahl von Nematoden. Die Empfindlichkeit unseres Assays war vergleichbar mit der früherer RT-qPCR-Studien. Bei diesen Studien wurde jedoch DNA aus Nematoden in einer Wassersuspension oder aus dem Boden extrahiert. Die Populationen von P. thornei und P. Neglectus konnten anhand von Bodenproben quantifiziert werden21,34,41. In unserer Studie wurde eine Diskrepanz zwischen Cq-Werten und der gezählten Anzahl an Nematoden festgestellt, was dadurch erklärt werden kann, dass Eier und inaktive/tote Nematoden auch direkt innerhalb der infizierten Wurzel nachgewiesen und quantifiziert werden können. Daher ist die Empfindlichkeit des RT-qPCR-Nachweistests höher als die der herkömmlichen visuellen Zählmethode.

Wir beobachteten auch Schwankungen in der Anzahl der Nematoden, die unter dem Mikroskop gezählt wurden. Diese können durch mehrere Faktoren erklärt werden, darunter eine mangelnde Effizienz der Nebelkammer, die nur die aktiven Stadien des Fadenwurms extrahieren kann, eine Verdünnung der nematodensynchronisierten Nematodensuspension zur visuellen Zählung und eine Variation in der Anzahl der Nematoden in verschiedenen biologischen Proben zur wandernden Lebensweise von Nematoden und zum Einfluss der Temperatur auf die Nematodenreproduktion. Alle traditionellen Extraktionsmethoden, wie die Nebelkammer, der Baermann-Trichter sowie die Whitehead- und Hemming-Tray-Techniken42,43, beruhen auf der aktiven Bewegung von Jungtieren und Erwachsenen aus angefeuchtetem Boden oder geschnittenem Gewebe in das umgebende Wasser. Im Falle einer Mischinfektion ist die Unterscheidung zwischen Pratylenchus-Arten unter dem Binokularmikroskop eine Herausforderung44. Darüber hinaus erschweren natürliche Variationen aufgrund phänotypischer Plastizität45 und morphometrischer Variationen zwischen und innerhalb von Arten die morphologische Identifizierung und Quantifizierung noch mehr17.

RT-qPCR erkennt DNA von Jungtieren, Erwachsenen und Eiern. Darüber hinaus sind alle Pratylenchus spp. Lebensstadien können innerhalb der Wurzel und/oder unter trockenen Bedingungen in einer inaktiven, dehydrierten und ruhenden anhydrobiotischen Form überleben31, die durch RT-qPCR nachgewiesen werden kann, mit herkömmlichen Methoden jedoch möglicherweise schwer nachzuweisen ist. Die Bestimmung der Anzahl der Nematoden im Boden ist entscheidend für die Festlegung wirtschaftlicher Schwellenwerte für die Einleitung von Gegenmaßnahmen wie dem Anbau resistenter Sorten. Die wirtschaftliche Schadensschwelle kann je nach geografischer Lage, Klima, Wirtstoleranz, Nematodenvirulenz, Marktwert der Kulturpflanze und Kosten der Bekämpfungsmaßnahmen erheblich variieren31. Beispielsweise berichteten Castillo und Vovlas7 über ein breites Spektrum von P. thornei-Schadensschwellen bei Weizen, die in Australien, Frankreich und Mexiko zwischen 420 und 30.000 Nematoden/kg Boden liegen. Da der beschriebene RT-qPCR-Nachweistest eine effektive, schnelle und kostengünstige Methode zur Schätzung der Nematodenzahlen auf der Grundlage von Cq-Werten ist, empfehlen wir eine neue Methode zur Schätzung der EDT mithilfe der generierten linearen Regression und ihrer Formel auf der Grundlage von Cq-Werten und/oder berechnete Anzahl von Nematoden.

Die DNA-basierte Krankheitserreger- und Schädlingsdiagnostik ist bei umfangreichen Untersuchungen von Bodenproben auf das Vorkommen pflanzenparasitärer und freilebender Nematoden bereits zur Routine geworden. Es ist allgemein anerkannt, dass die DNA-basierte Diagnostik an Bedeutung gewinnen wird. Basierend auf dieser Studie und den verfügbaren Informationen empfehlen wir die Verwendung der identifizierten optimalen Primerkombination und des auf SYBR® Green basierenden Detektions-RT-qPCR-Assays zur Identifizierung und Quantifizierung von P. Neglectus in Wassersuspension, Boden und infizierten Wurzeln. Es ermöglicht jedoch ein besseres Verständnis, wenn morphologische und molekulare Methoden kombiniert werden. Daher sollte der Ansatz auf der Grundlage des Zwecks der Studie, der Zeit, der Personalressourcen und des geschätzten Budgets bewertet werden. Der hier vorgestellte Nachweistest wird besonders für die Pflanzenzüchtung interessant sein, wo große Populationen schnell gescreent werden müssen.

Die Gerstensorte „Valentina“46,47 und die Weizensorte „Machete“48,49 sind beide anfällig für P. Neglectus. Im Experiment „A“ wurden Gersten- und Weizenpflanzen mit verschiedenen Pratylenchus-Arten geimpft, wobei 1000 Nematoden pro Pflanze verwendet wurden. Im Experiment „B“ wurden Gersten- und Weizenpflanzen mit einer zunehmenden Anzahl eines einzelnen P. Neglectus inokuliert. Die Gewächshausexperimente wurden in den Jahren 2021 und 2022 unter Verwendung der in Keil et al.47 beschriebenen Protokolle durchgeführt.

Die Samen wurden zwei Tage lang im Dunkeln bei 26 °C auf Whatman-Filterpapier gekeimt. Anschließend wurden die Sämlinge in zylindrische Kunststoffrohre mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Höhe von 15 cm verpflanzt, die mit hitzesterilisiertem Sand (Probau® Quarzsand eco, Körnung: 0,1–0,4 mm) gefüllt waren. Siebe mit einer Maschenweite von 20 µm Poren wurden am Boden der Röhrchen befestigt, um Sandverlust, Wurzelwachstum und das Entweichen von Nematoden während des Experiments zu verhindern. Die Pflanzen wurden zufällig mit einem Abstand von 8 × 8 cm zwischen den Röhrchen angeordnet. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus unter Langzeitbedingungen (16 Stunden Licht) bei 23 °C tagsüber und 18 °C nachts mit zusätzlichem Licht (Son-T Agro 400W, Koninklijke Philips Electronics NV, Eindhoven, Niederlande) gezüchtet. Die Pflanzen wurden zweimal pro Woche vom Boden der Röhrchen aus mit einer Nährlösung bewässert, wie von Marshall und Ellis50 beschrieben. Die Nährlösung wurde aus einem 100-l-Tank zugeführt und monatlich erneuert, um Veränderungen der Nährstoffkonzentrationen zu vermeiden. Alle Experimente wurden in einem vollständig randomisierten Design durchgeführt.

Die Nematoden (Ergänzungstabelle 1) wurden freundlicherweise vom Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik, Julius Kühn-Institut, Braunschweig, Deutschland, zur Verfügung gestellt und RLNs wurden auf monoxenischen Kulturen von Karottenkalli vermehrt und gehalten51,52. Zunächst wurden Karottenscheiben über einer Flamme oberflächensterilisiert und eine Woche lang bei 23 °C inkubiert. Als nächstes wurden die Nematoden mit Streptomycinsulfat (10 %) sterilisiert und 200 Nematoden in unterschiedlichen Entwicklungsstadien auf jede Scheibe gelegt. Anschließend wurde jede Petrischale mit einer Karottenscheibe mit Parafilm versiegelt und im Dunkeln bei 25 °C gelagert. Alle zwei Wochen wurden die Karottenscheibenkulturen auf Verunreinigungen überprüft. Neunzig Tage nach der Inokulation wurden die Nematoden für Gewächshaus-Infektionstests aus Karottenkalli extrahiert. Zur Herstellung des anfänglichen Inokulums wurden die Nematoden in drei 500-µl-Proben der Nematodensuspension gezählt. Das gesamte Inokulum wurde mit sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 500 Nematoden pro ml eingestellt. Anschließend wurden die Pflanzen mit 2 ml Nematodensuspension beimpft. Schließlich wurde eine gleiche Anzahl von vier Pratylenchus-Arten visuell gezählt und gemischt, um das Inokulum gemischter Nematodenarten herzustellen.

Sämlinge wurden vor der Nematodenimpfung zehn Tage lang im Gewächshaus gezüchtet. Nach der Beimpfung wurde der Sand mit schwarzen Plastikkügelchen bedeckt, um Algenwachstum zu verhindern. Acht Wochen nach der Inokulation wurden die Pflanzen geerntet. Das Trockengewicht der Triebe und Wurzeln wurde gemessen und der Chlorophyllgehalt mit einem Dualex-Instrument (Force A, Paris, Frankreich) nach Angaben von Casa et al.53 bestimmt. Danach wurden die Triebe geschnitten, die Hälfte der Wurzelproben zur DNA-Isolierung und RT-qPCR in einen Gefriertrockner gegeben und die andere Hälfte in eine Nebelkammer, um die Nematoden für die visuelle Zählung zu extrahieren. Die Anzahl der Nematoden pro Pflanze wurde in einem ml Suspension dreimal unter Verwendung eines Stereomikroskops (32-fache Vergrößerung) gezählt. Die Gesamtzahl der Nematoden wurde für die gesamte Nematodensuspension jeder Pflanze berechnet. Die Pf/Pi-Werte wurden als Verhältnis zwischen der Endzahl der Nematoden am Ende des Tests (Pf) dividiert durch die anfängliche Zahl der Nematoden, die zur Inokulation der Pflanzen verwendet wurden (Pi), berechnet.

Ein Protokoll zur Isolierung der Gesamt-DNA aus infizierten Getreidewurzeln, einschließlich Nematoden- und Pflanzen-DNA, wurde weiter modifiziert27. Nach der Ernte der Pflanzen acht Wochen nach der Inokulation wurde die gesamte Wurzel jeder Pflanze gefriergetrocknet und mit einem Geno/Grinder 2010 (SPEX@SamplePrep LLC, USA) drei Minuten lang bei 1000 Hüben pro Minute homogenisiert. Dann wurden fünf ml Extraktionspuffer pro Gramm trockene Wurzel hinzugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei 56 °C in einem Wasserbad inkubiert. Ein ml der homogenisierten Mischung wurde mit einem ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und Phenol (1:1) in einem frischen Röhrchen kombiniert, 10 Minuten lang kräftig geschüttelt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 13.000 U/min zentrifugiert (RT). Dann wurden 700 µl des Überstands in ein neues Röhrchen überführt und mit dem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) kombiniert, 10 Minuten lang geschüttelt und 10 Minuten lang bei 13.000 U/min bei RT zentrifugiert. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt und schließlich wurde die DNA durch Zugabe von 400 µl eiskaltem Isopropanol bei –20 °C über Nacht präzipitiert. Die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 U/min zentrifugiert, und die gesamten DNA-Pellets wurden anschließend fünf Minuten lang mit 70 % und 95 % Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen bei RT wurde die gesamte DNA in 200 µl niedrigem TE aufgelöst. Die Qualität der Gesamt-DNA wurde durch Gelelektrophorese überprüft und mit einem Qubit™ 4 Fluorometer (Invitrogen von ThermoFisher Scientific, Singapur) quantifiziert. Vor der RT-qPCR wurde die Gesamt-DNA auf eine Endkonzentration von 10 ng/µl verdünnt.

Nematoden-DNA wurde mit geringfügigen Modifikationen unter Verwendung des Protokolls von Al-Banna et al. extrahiert. (2004). Zunächst wurde eine bestimmte Anzahl von Nematoden, die nach der Zählung erhalten wurden, in 100 µl destilliertem Wasser gesammelt und dreimal für 30 Minuten bei –80 °C eingefroren und aufgetaut. Anschließend wurden 0,2 ml Extraktionspuffer mit 2 µl Proteinase K (Biotechrabbit™) hinzugefügt und die lysierten Nematoden über Nacht bei 56 °C in einem Wasserbad aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde nach dem Schütteln Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, die Phasen getrennt und die DNA mit einem Volumen kaltem Isopropanol bei −20 °C ausgefällt. Abschließend wurden die DNA-Pellets zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen und bei niedrigem TE aufgelöst.

Wir durchsuchten die Literatur und die Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) nach P. Neglectus-spezifischen Primerkombinationen. Wir fanden vier Primerkombinationen, die für PCR- und RT-qPCR-Studien verwendet wurden (Ergänzungstabelle 2). Da das Ziel dieser Studie darin bestand, einen schnellen, kostengünstigen und präzisen Nachweistest zu entwickeln, lag der Schwerpunkt auf der Verwendung der SYBR® Green-Methode. Die PCR wurde mit einem Life Touch Thermal Cycler (TC-96, Hangzhou Bioer Technology Co., LTD. China) in einem 20-µl-Volumen durchgeführt, das die DNA-Matrize (2 µl) und 0,1 µl Taq-Polymerase (Biozym Scientific GmbH) enthielt. , 0,4 µl 10 mM dNTPs, 0,3 µl 10 pM jedes Primers und 2 µl 10× PCR-Puffer (Biozym Scientific GmbH). Fünf µl der PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in 3 %igen Agarosegelen analysiert. Die Amplifikation erfolgte in einem Thermocycler unter Verwendung des folgenden Programms: 5 Minuten bei 94 °C als anfängliche Denaturierung; gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 94 °C zur Denaturierung; 30 s bei einer spezifischen Glühtemperatur jeder Primerkombination (Ergänzungstabelle 2), 30 s bei 72 °C für die Verlängerung und abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Darüber hinaus wurde das Echtzeit-PCR-Nachweissystem CFX ConnectTMOptics Module von Bio-Rad für RT-qPCR verwendet (Bio-Rad Laboratories, Inc., Singapur). Dazu wurden 10 µl Platinum® SYBR® Green (qPCR SuperMix-UDG mit ROX) (Invitrogen) mit fünf µl normalisierter DNA-Lösung mit zehn ng/µl, einem µl Primerlösung (10 pM) und 3 µl destilliertem Wasser gemischt. Der thermische Zyklus wurde für 3 Minuten bei 95 ° C als anfängliche Denaturierung programmiert, gefolgt von 40 Zyklen von 10 Sekunden bei 95 ° C zur Denaturierung, 30 Sekunden bei einer spezifischen Annealing-Temperatur jeder Primerkombination (Ergänzungstabelle 2), 30 Sekunden bei 72 °C für die Verlängerung und abschließende Verlängerung bei 95 °C für 10 s. Um die flankierte Sequenz mit jeder Primerkombination zu bestätigen, wurden PCR-Produkte aus spezifischen Primerkombinationen für P. Neglectus mithilfe von Sanger-Sequenzierung und CLC Main Workbench Version 23.0.3 (CLC Bio, Aarhus, Dänemark) sequenziert.

Das Primer3-Programm (Version 4.1.0) wurde für die Validierungslänge, Schmelztemperatur, GC-Gehalt und andere PCR-Amplifikationseigenschaften verwendet, wie z. B. die Optimierung des Primerdesigns basierend auf spezifischen PCR-Bedingungen wie Annealing-Temperatur, MgCl2-Konzentration und Template-DNA-Konzentration54. 55. Beacon Designer™ Free Edition und die mFold-Software wurden verwendet, um Sekundärstrukturen, ihre Schmelztemperaturen, die Stabilität von DNA-Duplexen und das Potenzial für DNA-Bindungsinteraktionen vorherzusagen55. Die Primersequenzen wurden mit der NCBI-Nukleotiddatenbank und dem Gerstenreferenzgenom (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) abgeglichen, um mutmaßliche unspezifische Bindungsstellen zu identifizieren55.

RT-qPCR-Daten wurden mit der Bio-Rad CFX Manager™-Softwareversion 3.1 analysiert. Die Amplifikationseffizienz (E) wurde aus der Steigung eines Diagramms des Quantifizierungszyklus (Cq) (y-Achse) und der logarithmischen Pikogramme (log pg) der DNA (x-Achse) unter Verwendung der Gleichung E = (10(1/) berechnet. –m) – 1) × 100, wobei m die Steigung56 ist. ANOVA wurde mit dem Programmpaket „Agricolae“ in der Software R Studio, Version 4.1.0, durchgeführt. und signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einen Tukey-Test berechnet (p < 0,05).

Die Autoren erklären, dass Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, aus diesem Manuskript und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Zusätzliche Daten, Informationen und Materialien, die in dieser Studie verwendet werden, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien durchgeführt. Die in dieser Studie erhaltenen Sequenzdaten sind in der GenBank des NCBI unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ unter den Zugangsnummern OR050567, KM593901, OR052247 und OR052248 offen verfügbar.

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Wir freuen uns über die technische Unterstützung durch Bettina Rohardt, Verena Kowalewski und Monika Bruisch. Darüber hinaus danken wir Professor Johannes Hallmann (Julius-Kühn-Institut, Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik, Braunschweig, Deutschland) für die Bereitstellung der Nematodenpopulationen. Diese Studie wurde teilweise vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert (Förderkennzeichen 031B0186A).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Pflanzenzüchtung, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Olshausenstr. 40, 24098, Kiel, Deutschland

Ehsan Fatemi, Siegbert Melzer & Christian Jung

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EF entwarf und führte die Experimente durch und analysierte anschließend die Daten. SM und CJ leiteten das Design der Studie und überwachten die Datenanalyse. Das Manuskript wurde von EFEF und SM verfasst und von CJ überarbeitet. Alle Autoren haben den endgültigen Artikel gelesen und genehmigt. Korrespondenz und Materialanfragen sind an CJ zu richten

Korrespondenz mit Christian Jung.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fatemi, E., Melzer, S. & Jung, C. DNA-basierte Bewertung von Wurzelläsionsnematodeninfektionen in Getreidewurzeln. Sci Rep 13, 12602 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39559-8

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Eingegangen: 12. Mai 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39559-8

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